mayo 24, 202425 de mayo de 2024

Efectos de las nanopartículas de óxido de grafeno sobre los biomarcadores del sistema inmunológico

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Efectos de las nanopartículas de óxido de grafeno sobre los biomarcadores del sistema inmunológico producidos por RAW 264.7 y cultivos de células sanguíneas enteras humanas

por: Kim Lategan, Hend Alghadi, Mohamed Bayati, María Fidalgo De Cortalezzi y  Piscina Edmundo

Departamento de Biociencia Médica, Universidad de Western Cape, Ciudad del Cabo 7535, Sudáfrica
Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de Missouri, Columbia, MO 65211, EE. UU.
Autor a quien debe dirigirse la correspondencia.
Nanomateriales 2018 , 8 (2), 125; https://doi.org/10.3390/nano8020125

Presentación recibida: 10 de diciembre de 2017/Revisado: 21 de enero de 2018/Aceptado: 22 de enero de 2018/Publicado: 24 de febrero de 2018

Abstracto:
Las nanopartículas de óxido de grafeno (GONP) han atraído mucha atención debido a sus múltiples aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen baterías, supercondensadores, administración de fármacos y biodetección. Sin embargo, pocos estudios han investigado los efectos de estas nanopartículas sobre el sistema inmunológico. En este estudio, los efectos in vitro de las GONP en el sistema inmunológico se evaluaron exponiendo macrófagos murinos, células RAW 264.7 y cultivos de células sanguíneas enteras humanas (a las GONP. Los efectos de las GONP en las células RAW se controlaron en condiciones basales. La sangre completa Los cultivos celulares se expusieron a GONP en presencia o ausencia de los mitógenos lipopolisacárido (LPS) y fitohemaglutinina (PHA). Se controlaron varios parámetros tanto para cultivos de células crudas como de sangre completa, que incluyeron citotoxicidad, biomarcadores inflamatorios y citoquinas adquiridas. sistema inmunológico y un análisis del perfil de proteoma Las GONP fueron citotóxicas tanto para cultivos de células sanguíneas crudas como para cultivos de células sanguíneas completas a 500 μg/ml. En ausencia de LPS, las GONP provocaron una respuesta inflamatoria de los cultivos de macrófagos murinos, de células crudas y sanguíneas completas a 15,6. y 5 μg/ml respectivamente. Esta activación se corroboró aún más mediante el análisis del perfil de proteoma de ambos cultivos experimentales. Las GONP inhibieron la síntesis de interleucina 6 (IL-6) inducida por PHA y la síntesis de interferón gamma (IFNγ) mediante cultivos de células sanguíneas completas en una dosis. manera dependiente. En ausencia de mitógenos, las GONP estimularon la síntesis de IL-10 mediante cultivos de células sanguíneas completas. El estudio actual muestra que las GONP modulan los biomarcadores del sistema inmunológico y que estos pueden representar un riesgo para la salud de las personas expuestas a este tipo de nanopartículas.

Palabras clave: nanopartículas de óxido de grafeno ; citotoxicidad ; activación de macrófagos ; respuesta inmune humoral

1. Introducción

El grafeno (G) es un material de carbono bidimensional (2-D), con una estructura hexagonal (red de panal) formada por átomos hibridados sp 2 , que ha sido aislado de su material parental tridimensional, el grafito [ 1 , 2 , 3 ]. El óxido de grafeno (GO) es un derivado de grafeno de una sola capa de carbono que contiene grupos funcionales que contienen oxígeno, como grupos carboxilo e hidroxilo [ 2 , 4 , 5 ]. Estos grupos se adquieren cuando el grafeno se oxida [ 2 ]. Estas nanopartículas de grafeno oxidado poseen características únicas como conductividad térmica y electrónica, resistencia mecánica superior y propiedades ópticas [ 6 ]. Debido a estas excepcionales propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas de óxido de grafeno (GONP), tiene una amplia gama de aplicaciones en varios campos. Estos campos incluyen electroquímica, biomedicina, biodetección, administración de fármacos, baterías de alta capacidad energética y supercondensadores, por nombrar algunos. Sin embargo, estas propiedades no garantizan necesariamente que los GONP sean buenos portadores de medicamentos [ 2 , 5 ].Debido a las aplicaciones de las GONP, es inevitable que estas nanopartículas se liberen al medio ambiente y puedan afectar directa o indirectamente la salud humana. Por lo tanto, es imperativo que se investiguen los efectos de GO. Como las nanopartículas, debido a sus propiedades, pueden transportarse fácilmente, lo que altera la biodisponibilidad y afecta la toxicidad celular [ 7 ]. GO no se descubrió hasta 2004 y, desde su descubrimiento, pocos estudios han informado sobre sus efectos sobre el sistema inmunológico [ 2 ]. El óxido de grafeno indujo estrés oxidativo e inmunotoxicidad in vivo en el pez cebra [ 1 ]. Tras la exposición in vitro a GONP, se registraron disminución de la viabilidad celular, daño en el ADN, aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) e inducción de factores inflamatorios [ 4 , 8 , 9 ]. Las citoquinas seleccionadas en este estudio in vitro (es decir, IL-6, IL-10 e IFNγ) son indicativas de los sistemas inmunológicos inflamatorio, humoral y celular, respectivamente. Cada uno de ellos desempeña roles diferentes pero interconectados. IL-6 tiene la capacidad de estimular la proliferación de células T y su diferenciación en células T citotóxicas, estimulando la producción de anticuerpos y la inducción de proteínas de fase aguda [ 10 , 11 ]. Mientras que la IL-10 tiene la capacidad única de inhibir la expresión y producción de muchos genes inducibles por lipopolisacáridos (LPS), principalmente citoquinas proinflamatorias, por parte de los macrófagos [ 12 , 13 ]. Y el IFNγ es producido principalmente por células T CD4 + o CD8 + activadas y células asesinas naturales (NK) y se reconoce como el principal mediador de la inmunidad innata y adaptativa [ 14 , 15 ]. Por lo tanto, validar su selección como GONP podría resultar potencialmente en inmunotoxicidad. Los estudios también demostraron que las GONP exhibían efectos antibacterianos contra bacterias gramnegativas y grampositivas [ 16 ].El objetivo del estudio actual fue investigar los efectos in vitro de las GONP en el sistema inmunológico mediante la exposición de la línea celular de macrófagos murinos, RAW 264.7 y cultivos de células sanguíneas humanas enteras a las GONP. Se monitorearon varios biomarcadores del sistema inmunológico, como citotoxicidad, biomarcadores inflamatorios, citocinas del sistema inmunológico adquirido y un análisis del perfil del proteoma de citocinas y quimiocinas expresadas tras la exposición a GONP.

2. Resultados

2.1. Los efectos de las GONP en las células RAW 264.7

2.1.1. Los efectos de las GONP sobre la viabilidad de las células RAW 264.7Las GONP en concentraciones ≤ 31,25 μg/ml no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular ( Figura 1 a). Sin embargo, las concentraciones de GONP ≥ 62,5 μg/ml redujeron significativamente ( p <0,001) la viabilidad celular. A la concentración más alta de GONP analizada (500 μg/ml), la viabilidad de las células fue inferior al 60 % de la viabilidad de las células de control (células que no recibieron GONP).
2.1.2. Los efectos de las GONP sobre el biomarcador del sistema inflamatorio óxido nítrico (NO) utilizando células RAW 264.7Las GONP no tuvieron ningún efecto sobre la respuesta inflamatoria de las células en un ambiente no estimulado en todas las concentraciones monitoreadas en este estudio ( Figura 1 b). En los resultados se incluye un control estimulado con LPS sin ninguna nanopartícula para verificar que los datos obtenidos no se deben a ningún artefacto que se haya generado debido a la exposición de las GONP a las células.
2.1.3. Los efectos de las GONP sobre el biomarcador IL-6 del sistema inflamatorio utilizando células RAW 264.7Las GONP en condiciones no estimuladas indujeron una regulación positiva significativa ( p <0,001) de IL-6 a 15,6 y 31,25 μg/ml respectivamente, en comparación con el cultivo de control que no estuvo expuesto a GONP ( Figura 1 c). Por el contrario, la síntesis de IL-6 no se vio afectada cuando los cultivos se expusieron a concentraciones de GONP ≥ 62,5 μg/ml. Los resultados que representan cultivos estimulados con LPS sin exposición a nanopartículas no se incluyeron en el gráfico debido a la gran escala de los datos.
2.1.4. Los efectos de las GONP sobre las quimiocinas MIP utilizando células RAW 264.7

Los efectos de las GONP en MIP-1α utilizando células RAW 264.7Las GONP en el rango de 15,6 a 62,5 μg / ml en los medios solo notablemente ( p <0,001) aumentaron la síntesis de MIP-1α, en comparación con el control de cultivo no expuesto a GONP ( Figura 1 d). Sin embargo, las concentraciones de GONP ≥ 125 μg/ml disminuyeron significativamente la síntesis de MIP-1α en comparación con el control de cultivo que no estuvo expuesto a GONP. Los resultados de los cultivos de control expuestos a medios en presencia de un mitógeno únicamente (803,85 ± 353,70 ng/ml MIP-1α) no se incluyen en la figura.

Los efectos de las GONP en MIP-1β utilizando células RAW 264.7Los cultivos expuestos a concentraciones de GONP en el rango de 15,6 a 31,25 aumentaron significativamente ( p <0,001) la cantidad de MIP-1β secretada por las células RAW en comparación con el control de cultivo no expuesto a GONP ( Figura 1 e). Por otro lado, las concentraciones de GONP ≥ 62,5 μg/ml redujeron significativamente la síntesis de MIP-1β en comparación con el control de cultivo que no contenía nanopartículas. Los resultados de los medios expuestos únicamente a LPS en ausencia de GONP (1127,19 ± 468,69 ng/mL MIP-1β) no se incluyen en la figura.

Los efectos de las GONP en MIP-2 utilizando células RAW 264.7Las concentraciones de GONP ≤ 62,5 μg/ml aumentaron significativamente ( p <0,001) la síntesis de MIP-2 en comparación con los cultivos de control expuestos a medios solo sin ninguna nanopartícula ( Figura 1 f). La síntesis de MIP-2 no se vio afectada por concentraciones de GONP ≥ 125 μg/ml. Los medios en presencia de LPS sin GONP (307,39 ± 171,86 ng/mL MIP-2) no están incluidos en la figura.

2.1.5. Perfil secretor de citocinas y quimiocinas de células RAW 264.7 tras el tratamiento con GONPLas membranas expuestas solo a medios, medios en presencia de un mitógeno y GONP de 15,6 μg/ml permitieron el análisis de diversas citocinas y quimiocinas expresadas por las células tras la exposición relativa ( Figura 2 ). La cuantificación de las membranas mostró que la respuesta inflamatoria simulada (medios en presencia de LPS) permitió a las células secretar ciertas citocinas y quimiocinas que no fueron sintetizadas por las células cuando se expusieron a los medios únicamente y a 15,6 μg/ml de GONP. Estas proteínas incluyen: proteína 10 inducible por IFNγ (IP-10); factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); IL-6; factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF); interleucina 27 (IL-27); antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1ra); e IL-β.Sin embargo, la exposición de células RAW a 15,6 μg/mL de GONP en ausencia de un mitógeno afectó la síntesis de ciertas proteínas que diferían significativamente ( p < 0,001) tanto de las negativas (solo medios) como de las positivas (medios en presencia de LPS). ) control S. Estas citocinas y quimiocinas incluyen: factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); factor de necrosis tumoral α (TNF-α); proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1)/JE; molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1); MIP-1α; MIP-2; regulado por activación, células T normales expresadas y secretadas (RANTES); y factor 1 derivado de células estromales (SDF-1) ( Figura 3 ).
2.2. Los efectos de las GONP en cultivos de células sanguíneas enteras

2.2.1. Los efectos de las GONP sobre la viabilidad de los cultivos de células sanguíneas completasLas concentraciones de GONP ≤ 50 μg/ml no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular ( Figura 4 ). Sin embargo, la concentración más alta de GONP evaluada, 500 μg/mL, redujo significativamente ( p < 0,003) la viabilidad en comparación con los cultivos expuestos a medios solo en ausencia de GONP.
2.2.2. Los efectos de las GONP sobre el biomarcador IL-6 del sistema inflamatorio mediante cultivos de células sanguíneas completasLos cultivos expuestos a GONP solos significativamente ( p <0,001) aumentaron significativamente la liberación de IL-6 de las células en todas las concentraciones monitoreadas en comparación con el control del cultivo expuesto solo a medios ( Figura 5 a). Por el contrario, las concentraciones de GONP en presencia de LPS redujeron significativamente ( p <0,002) la secreción de IL-6 de las células de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control, expuesto a medios que solo contenían el mitógeno.
2.2.3. Los efectos de las GONP sobre la quimiocina inflamatoria MIP-1β mediante cultivos de células sanguíneas completasMIP-1β fue regulado significativamente ( p <0,001) por las GONP en condiciones no estimuladas a 5 y 50 μg/ml respectivamente, en comparación con el control de cultivo, que no contenía ninguna nanopartícula ( Figura 5 b). Sin embargo, bajo una respuesta inflamatoria simulada, las GONP exhibieron una reducción prominente ( p <0,001) en la síntesis de MIP-1β en concentraciones ≥ 50 μg/ml en comparación con el control de cultivo, medios que solo contenían LPS.
2.2.4. Los efectos de las GONP sobre el biomarcador IL-10 del sistema inmunológico humoral mediante cultivos de células sanguíneas completasLas concentraciones de GONP ≤ 50 μg/ml en ausencia de PHA aumentaron significativamente ( p <0,002) la producción de IL-10 en comparación con el control de cultivo, que no contenía nanopartículas ( Figura 6 a). Sin embargo, la concentración más alta (500 μg/ml) de los cultivos no estimulados no tuvo ningún efecto sobre la respuesta inmune adaptativa. Por otro lado, las concentraciones de GONP en presencia de PHA inhibieron significativamente ( p <0,001) la secreción de IL-10 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control del cultivo, que solo contenía PHA.
2.2.5. Los efectos de las GONP en el biomarcador del sistema inmunológico mediado por células, IFNγ, utilizando cultivos de células sanguíneas completasLas concentraciones de GONP no afectaron la citocina mediada por células, IFNγ, en condiciones normales (es decir, en ausencia de PHA) ( Figura 6 b). Sin embargo, las GONP en particular ( p <0,001) redujeron la síntesis de IFNγ de una manera dependiente de la dosis en cultivos estimulados con PHA en comparación con los medios que solo contenían PHA (control de cultivo). Esta disminución dependiente de la dosis de IFNγ imitó la respuesta de la otra citoquina inmune adaptativa, IL-10 ( Figura 6 a).
2.2.6. Perfil secretor de citocinas y quimiocinas de cultivos de células sanguíneas completas tras el tratamiento con GONPEl perfil del proteoma de cultivos de células sanguíneas enteras expuestos solo a medios (control negativo), medios que contienen el mitógeno, LPS (control positivo) y 5 μg/mL de GONP en ausencia de un estímulo reveló cambios notables en la síntesis o inhibición de una serie de de citocinas y quimiocinas ( Figura 7 ).La figura 8 representa la cuantificación de las membranas. Los cultivos de células sanguíneas enteras expuestos a GONP provocaron una regulación positiva significativa del factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), MCP-1 y la interleucina 8 (IL-8) en comparación con ambos controles. Los GONP también aumentaron notablemente la serpina E1, RANTES e ICAM-1 en comparación con el control negativo. Las citocinas y quimiocinas que estaban notablemente reguladas negativamente en comparación con el control positivo incluyen IL-1ra, MIP-1α/β, IL-6 e IL-1β ( Figura 8 ). Las células sanguíneas enteras expuestas únicamente al medio (control negativo) no sintetizaron las siguientes citoquinas: IL-1ra, MCP-1, MIP-1α/β, IL-6, IL-8 e IL-1β.


3. Discusión

El grafeno ha atraído mucha atención debido a sus numerosas aplicaciones industriales y médicas potenciales. Sin embargo, se sabe muy poco sobre los efectos de estas nanopartículas en el sistema inmunológico. La exposición de células RAW a GONP indujo citotoxicidad en la concentración más alta (500 μg/ml). Li et al. obtuvieron datos similares. que expusieron grafeno prístino a células RAW 264,7 [ 17 ]. Propusieron que las GONP ejercían sus efectos citotóxicos al agotar el potencial de la membrana mitocondrial y aumentar la producción de ROS. La disminución de la viabilidad celular también podría atribuirse a la mayor capacidad de los macrófagos para internalizar GO y esto podría haber afectado el ensamblaje de actina dentro de la célula [ 18 , 19 ]. También se informó de una reducción en la viabilidad celular al exponer células THP-1 humanas a GONP, lo que indica efectos citotóxicos constantes contra macrófagos y monocitos, independientemente de la especie [ 4 ].En el estudio actual, los datos de perfiles inflamatorios y proteomas para GONP, en condiciones basales, aumentaron la síntesis de citocinas y quimiocinas inflamatorias como NO, IL-6, TNF-α, MIP y RANTES. Estos hallazgos fueron corroborados por Orecchioni et al. como se informó que, las GONP estimularon significativamente la secreción de citocinas Th 1 / Th 2 , como IL-1a, IL-6, IL-10, TNF-α y GM-CSF, así como quimiocinas como MCP-1. , MIP-1α, MIP-1β y RANTES en macrófagos murinos primarios e inmortalizados [ 20 ]. Esto indica la activación de los macrófagos por GONP y potencialmente podría atribuirse a la interacción de GONP con los receptores tipo peaje [ 21 , 22 ]. Feito et al. encontró que las células RAW 264.7 expuestas a poli (etilenglicol-amina) (PEG) funcionalizaban el TNF-α con regulación positiva de GO en condiciones basales y estimuladas con LPS [ 18 ]. Se encontró que la IL-6 estaba regulada negativamente a 25 y 100 μg/ml de GO en una respuesta inflamatoria simulada (+LPS). No se observaron diferencias en los niveles de IL-6 en condiciones basales. El resultado de TNF-α obtenido por Feito et al. es consistente con lo que se encontró en el estudio actual utilizando perfiles de proteoma [ 18 ]. La citocina inflamatoria, IL-6, se reguló significativamente a 15,6 y 31,25 μg/ml en ausencia de un mitógeno en el estudio actual. Esto es contradictorio con lo encontrado por Feito et al, pero podría atribuirse a la funcionalización de GO [ 18 ]. La funcionalización de nanopartículas con polímeros biocompatibles aumenta su estabilidad en condiciones fisiológicas. También minimiza sus interacciones con otras biomoléculas y reduce las respuestas inmunológicas [ 8 , 18 ]. Los efectos de las GONP en las células RAW, en condiciones estimuladas con LPS, no se evaluaron en el estudio actual.De manera similar a las células RAW, las GONP también indujeron citotoxicidad en cultivos de células sanguíneas enteras a 500 μg/ml, y Orecchioni et al. expuso GONP a células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y descubrió que inducía sus efectos citotóxicos al inducir la apoptosis mediada por ROS [ 6 , 23 ]. Zhi et al. También encontró que GO indujo la apoptosis en los linfocitos T de una manera dependiente de la dosis [ 24 ].La exposición de cultivos de células sanguíneas enteras a GONP también indujo la regulación positiva de las citocinas inflamatorias IL-6 y MIP-1β en condiciones basales/no estimuladas. Esta activación de la respuesta inflamatoria podría atribuirse a la activación del sistema del complemento que resulta en la producción de anafilatoxinas (mediadores proinflamatorios). Esto puede ocurrir porque los componentes del sistema del complemento pueden detectar GO tan pronto como GO se introduce en un sistema biológico [ 25 ]. La activación del sistema del complemento fue estudiada por Wibroe et al. quienes encontraron que había un aumento en C5a, que es un marcador de la activación del sistema del complemento cuando se expone suero humano a GO [ 26 ]. Wibroe et al. También descubrió que GO reducía la síntesis de IL-6 cuando el suero humano era estimulado por LPS, lo que concuerda con lo encontrado en este estudio [ 26 ]. Los datos del perfil de proteoma obtenidos en el estudio actual confirmaron que las citocinas y quimiocinas inflamatorias se activaron cuando los cultivos de células sanguíneas enteras se expusieron a 5 μg/ml de GONP. En particular, las GONP regulaban positivamente IL-1ra, MCP-1, MIP-1α/β e IL-8.Las GONP no solo inhibieron una respuesta inflamatoria de manera dosis dependiente, sino que también modularon las citoquinas que regulan las respuestas inmunes adaptativas. Las GONP estimularon la síntesis de la citocina humoral reguladora del sistema inmune, IL-10, pero no afectaron la respuesta mediada por células que regula la citoquina, IFNγ, de cultivos de células sanguíneas completas en condiciones basales/no estimuladas. Esto indica que las GONP inducirían la diferenciación de células Th 0 a células Th 2 . Luego, las interleucina 4 y 10 (IL-4 e IL-10) estimulan a los linfocitos B para que produzcan anticuerpos para combatir la exposición a las GONP [ 27 ]. Sin embargo, las respuestas de IL-10 e IFNγ en cultivos de células sanguíneas completas en condiciones estimuladas por PHA fueron reguladas negativamente por las GONP.Este estudio indica claramente que las GONP son citotóxicas en altas concentraciones y estimulan la activación de respuestas inflamatorias en condiciones basales/no estimuladas. Esta activación/estimulación de una respuesta inflamatoria podría causar autoinmunidad en individuos expuestos a GONP [ 28 ]. En condiciones basales/no estimuladas, las GONP también estimularían una respuesta inmune humoral en individuos expuestos a ellas. Sin embargo, en condiciones estimuladas que imitaban una infección, las respuestas humorales y celulares estaban reguladas a la baja, lo que indica una posible inmunosupresión por la exposición a GONP en individuos con una infección.Los datos obtenidos en el estudio actual son cruciales para la gestión de riesgos de las personas tras la exposición a GONP, ya que estas nanopartículas podrían usarse in vivo como sistemas de administración de fármacos, entre otras aplicaciones. Los GONP también pueden liberarse al medio ambiente y potencialmente afectar la salud humana.

4. Materiales y métodos

4.1. Síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de grafeno (GONP)Las nanopartículas de óxido de grafeno se sintetizaron según un método de Hummers modificado [ 29 ], caracterizado y obtenido de la Universidad de Missouri. Las láminas de grafeno se visualizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL 1400, Peabody, MA, EE. UU.). Una caracterización adicional reveló que las partículas tenían una absorbancia máxima a 227 nm con espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-vis) (Lab Tech, UV 8100B, Hopkinton, MA, EE. UU.), con un rango de escaneo de 200 a 600 nm. Se detectaron varios grupos funcionales de superficie (es decir, grupos hidroxilo y carboxilo) mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) en un espectrofotómetro FT-IR Nicolet 4700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y los espectros se recogieron durante un número de onda varía de 400 a 4000 cm −1 . La movilidad electroforética (EPM) de los nanomateriales se midió con un ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) en varias soluciones de electrolitos mediante velocimetría láser Doppler. Los EPM se convirtieron a potencial zeta utilizando la ecuación de Smoluchowski (Ecuación (1)) [ 30 ]:U = εζ/μ,donde U es la movilidad electroforética, ε es la constante dieléctrica de la solución, μ es su viscosidad y ζ es el potencial zeta. Se emplearon células capilares plegadas desechables. El potencial zeta indicó un potencial superficial de −49,2 mV a pH 7 y una fuerza iónica de fondo de 10 mM, NaCl (consulte el Apéndice A ).
4.2. Preparación de GONPSe preparó una solución madre de 10 mg/ml de GONP en agua destilada. Los GONP se sonicaron (QSonica, LLC. Misonixsonicators, XL-200 Series, Newtown, CT, EE. UU.) en períodos cortos, un hielo, durante un total de aproximadamente 90 minutos. Se congelaron alícuotas de la solución madre a -80 °C hasta su uso. Antes de su uso en experimentos, las nanopartículas se descongelaron y se sonicaron adicionalmente en ráfagas cortas en hielo durante 5 minutos.
4.3. CRUDO 264,7 celdas

4.3.1. Ensayo de macrófagos RAW 264.7La línea celular de macrófagos murinos, RAW 264.7, se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC TIB-71, Manassas, VA, EE. UU.). Las células RAW 264.7 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Lonza, Ciudad del Cabo, Sudáfrica) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS, Hyclone, Little Chalfont, Reino Unido), glutamax (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), antibiótico/antimicótico (Sigma-aldrich) y gentamicina (Sigma-aldrich). Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 a 37 °C y las células se subcultivaron cada 2 a 3 días.Las células RAW 264.7 (1 x 10 5 células/ml) se cultivaron en placas de 48 pocillos tratadas con cultivo celular y se incubaron en una atmósfera humidificada con 5 % de CO 2 a 37 °C durante aproximadamente 48 h hasta que las células alcanzaron una confluencia del 80 % al 90 %. . Después del período de incubación, se retiró el medio y se reemplazó con medio que contenía FBS al 2,5%. Los procedimientos posteriores se produjeron en medios libres de suero. Las células se preexpusieron durante 2 h a diversas concentraciones de GONP. Posteriormente las células se dejaron sin estimular y también estuvo presente un control positivo. El control positivo fueron células estimuladas únicamente por lipopolisacárido (LPS) (1 µg/ml) sin la presencia de nanopartículas y esto imitaría una respuesta inmune inflamatoria. La concentración final de FBS/pocillo fue del 0,5%. Los cultivos se incubaron durante la noche (~18 h) en condiciones estándar de cultivo de tejidos. Se recogieron sobrenadantes de cultivo para análisis de óxido nítrico (NO), interleucina 6 (IL-6), proteína inflamatoria de macrófagos 1α (MIP-1α), MIP-1β, MIP-2 y perfiles de proteoma.
4.3.2. Ensayo de citotoxicidadDespués de la eliminación de los sobrenadantes, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (Lonza), suplementada con glutamax, solución antibiótica/antimicótica. La citotoxicidad se midió añadiendo 150 µl de una dilución 1/10 de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H- tetrazolio (WST-1, Roche , Basilea, Suiza) reactivo en medio sin suero a cada pocillo. Las células metabólicamente activas convierten el reactivo WST-1 en un formazán que puede medirse espectrofotométricamente. La formación de formazán se determinó leyendo la placa a 450 nm (Multiskan Ex, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, EE. UU.) inmediatamente después de la adición de WST-1 y nuevamente después de un período de incubación de 1 h a 37 °C. El aumento de la absorbancia a 450 nm es proporcional a la formación de formazán. El nivel de fomazán formado es directamente proporcional a la viabilidad celular.
4.3.3. SIN determinaciónDespués de la incubación durante la noche de las células RAW 264.7, se midió la cantidad de nitrito producido por las células en el sobrenadante del cultivo como una indicación de la producción de NO. El ensayo de NO se basa en la reacción de Griess [ 31 ]. La cantidad de producción de NO se midió frente a un rango de dilución al doble de un estándar de nitrito de 100 μM (Sigma-aldrich). Los estándares de nitrito o el sobrenadante del cultivo recogido (100 µl) se mezclaron con 100 µl de reactivo de Griess (1:1 de sulfanilamida al 1 % y diclorhidrato de naftiletlemidimina al 0,1 % en ácido fosfórico al 2,5 %) (todos los reactivos se obtuvieron de Sigma-aldrich). Posteriormente, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. La absorbancia se leyó a 540 nm mediante un lector de microplacas (Multiskan Ex, Thermo Electron Corporation) y se cuantificó la cantidad de NO producida por las células RAW.
4.3.4. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) de sándwich de doble anticuerpo (DAS) de IL-6 de ratónSe utilizaron kits ELISA de IL-6 de ratón (e-Bioscience, Ready-Set-Go, Waltham, MA, EE. UU.) para medir los niveles de citoquinas IL-6 en los sobrenadantes del cultivo celular. El control estimulado con LPS se analizó a (1/40) mientras que el control negativo (no tratado con LPS) se analizó a (1/5) en diluyente de ensayo. Los ensayos se realizaron en placas Nunc maxisorb de 96 pocillos. El kit contenía todos los reactivos para el ensayo y se realizó según las instrucciones del fabricante (ver anexo).
4.3.5. MIP de ratón (MIP-1α, MIP-1β y MIP-2) DAS ELISASe realizaron ELISA de ratón MIP-1α, MIP-1β y MIP-2 (R & D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) en las muestras y en los sobrenadantes de cultivo estimulados con LPS. Los kits contenían todos los reactivos necesarios para el experimento y los experimentos se realizaron según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se diluyeron en diluyente de reactivo, albúmina sérica humana (HSA) al 1% ( p / v ). Las muestras de MIP-1α se analizaron a 1/270 y el sobrenadante estimulado con LPS a 1/10.000. Para el ELISA MIP-1β, los sobrenadantes del cultivo no estimulado se analizaron a 1/20 mientras que los sobrenadantes estimulados con LPS se analizaron a 1/5000. Los sobrenadantes no estimulados de ELISA MIP-2 se ensayaron a 1/100 y el sobrenadante estimulado con mitógeno a 1/1000.
4.3.6. Ensayo de perfilado de proteoma de ratónSe utilizó un kit de matriz de anticuerpos disponible comercialmente (Proteome Profiler, Mouse cytokine Array Panel A, R & D Systems) que se recubrió con 40 anticuerpos de captura por duplicado en una membrana de nitrocelulosa (transferencia puntual). El kit contenía todos los reactivos para el ensayo y se realizó según las instrucciones del fabricante. Esta matriz de anticuerpos de citocinas y quimiocinas se utilizó para determinar los efectos de la exposición a GONP sobre citocinas y quimiocinas mediante células de macrófagos RAW 264.7. El ensayo requirió 500 μL de sobrenadantes de cultivo celular (GONP de 0 μg/mL no estimuladas, GONP de 0 μg/mL estimuladas con LPS y GONP de 0 μg/mL estimuladas y GONP de 15,6 μg/ml no estimuladas). Las membranas se sometieron a un sustrato de membrana cromogénico ultrasensible de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para revelar complejos muestra-anticuerpo marcados con estreptavidina-HRP. Se tomaron fotografías de las transferencias después de la exposición al sustrato.
4.3.7. Cuantificación de la densidad de píxeles para membranas de citocinas y quimiocinasLas imágenes de membrana se cuantificaron utilizando el software Java de análisis y procesamiento de imágenes (versión 1.6.0_24, Oracle Corporation, Redwood City, CA, EE. UU.), ImageJ (versión 1.4.3.67, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.). Los niveles de citocinas y quimiocinas se expresaron como porcentaje del punto de referencia. Se utilizó Microsoft Excel para calcular los porcentajes que se expresan como media ± desviación estándar (DE).
4.4. Cultivo de células sanguíneas completas

4.4.1. Recogida de sangreUn médico/enfermera extrajo sangre de un hombre sano que no estaba usando ningún medicamento. La sangre se recogió mediante venopunción directamente en tubos de vacío con citrato de sodio al 3,2% (Greiner bio-one). La sangre fue procesada inmediatamente. Los cultivos de células sanguíneas completas se realizaron en condiciones estériles. La autorización ética se obtuvo de la Universidad de Western Cape (Ética No. 10/9/43). También se obtuvo el consentimiento informado del participante.
4.4.2. Cultivo de célulasSe diluyó sangre entera humana con medio Roswell Parks Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-aldrich) para dar lugar a una mezcla al 10% ( v / v ). La sangre se dejó sin estimular o se estimuló con LPS (Sigma-aldrich) (0,1 μg/ml) o fitohemaglutinina (PHA) (Sigma-aldrich) (1,6 μg/ml). Las condiciones estimuladas imitarían una respuesta inmune inflamatoria y adquirida respectivamente. Los cultivos de células sanguíneas estimuladas o no estimuladas se incubaron durante la noche a 37 ° C con concentraciones altas, intermedias y bajas de GONP en una placa tratada con cultivo de tejidos de 24 pocillos (Nunc, Waltham, MA, EE. UU.). Junto con la exposición a las nanopartículas, también estuvo presente un control positivo de Tween20 al 0,01% (Merck, Modderfontein, Sudáfrica). Después del período de incubación, se analizó la citotoxicidad de los sobrenadantes del cultivo mediante un ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH), marcadores inflamatorios IL-6 y MIP-1β, interleucina 10 (IL-10) e interferón gamma (IFNγ).
4.4.3. Ensayo de LDHDespués de la incubación durante la noche, se analizó la citotoxicidad de una alícuota de los sobrenadantes del cultivo de células sanguíneas completas no estimuladas y se midió la liberación de LDH de las células (kit colorimétrico II de citotoxicidad de LDH, BioVision, Milpitas, CA, EE. UU.). El kit contenía todos los reactivos para el ensayo y se realizó según las instrucciones del fabricante.
4.4.4. Análisis de citocinas mediante DAS ELISASe utilizaron kits disponibles comercialmente (e-Bioscience, Ready-Set-Go) para analizar el nivel de secreción de citocinas de los cultivos de células sanguíneas completas. Los kits se utilizaron según las instrucciones del fabricante y contenían todos los reactivos para completar el ensayo. Las muestras no estimuladas y estimuladas con LPS se analizaron usando una dilución 1/10 para el ensayo de IL-6. Mientras que las muestras no estimuladas y estimuladas con PHA se analizaron puras para análisis de IL-10 e IFNγ. Se utilizó el mismo protocolo que el descrito anteriormente para el ELISA de citoquinas de ratón.
4.4.5. ELISA MIP-1β DAS humanoSe realizó un ELISA de MIP-1β humano (R & D Systems) en los sobrenadantes de cultivos no estimulados y estimulados con LPS de los cultivos de células sanguíneas completas. Las muestras se diluyeron 1/10 en diluyente de reactivo, albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (Sigma-aldrich). Se siguió el mismo protocolo que los ELISA de MIP de ratón.
4.4.6. Perfil del proteoma humanoSe utilizó un kit de matriz de anticuerpos disponible comercialmente (Proteome Profiler, Human Cytokine Array Kit, R & D Systems) que se recubrió con 36 anticuerpos de captura por duplicado en una membrana de nitrocelulosa (transferencia puntual). El kit contenía todos los reactivos para el ensayo y se realizó según las instrucciones del fabricante. Esta matriz de anticuerpos de citocinas y quimiocinas se utilizó para determinar los efectos de las GONP sobre la secreción de citocinas y quimiocinas cuando se exponen a cultivos de células sanguíneas completas. El ensayo requirió 500 μL de sobrenadantes de cultivo celular (GONP de 0 μg/mL no estimuladas, GONP de 0 μg/mL estimuladas con LPS y GONP de 5 μg/mL no estimuladas). Los pasos posteriores se llevaron a cabo como se describe para el perfil de proteoma de quimiocinas y citocinas de ratón.
4.5. Análisis estadísticoTodos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se calcularon utilizando Microsoft Excel. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando SigmaPlot 12.0 (Systat Software Inc., San José, CA, EE. UU.) para evaluar las diferencias estadísticas, considerándose significativo p <0,01.

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer a la Fundación Nacional de Investigación (NRF) por financiar este estudio.

Contribuciones de autor

Edmund Pool concibió y diseñó los experimentos in vitro. También ayudó a escribir el manuscrito. María Fidalgo concibió, diseñó y ayudó en la redacción de los experimentos de GONP; Mohamed Bayati sintetizó, caracterizó y redactó los GONP; Kim Lategan y Hend Alghadi realizaron los experimentos y analizaron los datos; Kim Lategan escribió el artículo.

Conflictos de interés
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Apéndice A

Los espectros FTIR de GO se presentan en la Figura A1 . Se confirmaron diferentes tipos de funcionalidades del oxígeno en el espectro GO: a 3300 cm −1 (vibración de estiramiento O – H), a 1740 cm −1 (vibración de estiramiento de C=O), a 1619 cm −1 (estiramiento C=C) , a 1360 cm −1 (estiramiento C – O), a 1201 cm −1 (vibración de estiramiento C – OH) y finalmente a 1060 cm −1 (vibración de estiramiento C – O). Los espectros de adsorción UV-vis de las láminas GO mostraron un pico característico a 227 nm ( Figura A2 ) debido a la transición π→π* de los enlaces C=C. La Figura A3 muestra una imagen TEM representativa de una partícula GO, sedimentada a partir de una suspensión a pH = 5,2 y ausencia de electrolitos agregados, lo que evidencia su morfología bidimensional. Las dimensiones de las láminas observadas fueron de aproximadamente 1 a 2 µm, aunque se detectaron algunas partículas más pequeñas probablemente debido a la rotura parcial de las láminas GO iniciales. Sin embargo, en presencia de NaCl 10 mM, el tamaño de las láminas de GO disminuyó de 1555 ± 248,57 nm a 519,97 ± 36,59 nm a medida que el pH aumentó de 2 a 11 ( Tabla A1 ). La Figura A4 muestra que el potencial ζ de las partículas GO fue negativo en el rango de pH de 2 a 11. En presencia de NaCl 10 mM, los valores del potencial ζ disminuyeron de −23,24 ± 0,72 a −51,1 ± 1,04 mV a medida que aumentaba el pH. de 2 a 11 debido a la desprotonación de grupos funcionales de oxígeno [ 32 ]. La curva de potencial ζ versus pH mostró dos puntos de inflexión, ubicados alrededor de pH 4 y pH 9. Los espectros FTIR ( Figura A1 ) mostraron que GO tiene dos tipos de grupos ácidos: carboxílicos (pKa, 4,3) e hidroxílicos (pKa, 9,3). ); El aumento de cargas negativas en las hojas GO resultó de la ionización de estos dos grupos [ 33 ].

Figura A1. Análisis de GONP por espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR).

Figura A2. Espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-vis) de GONP, con absorbancia máxima a 227 nm.

Figura A3. Visualización de láminas de grafeno mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Figura A4. Potencial zeta de GONP bajo diferentes niveles de pH, mientras se mantiene una concentración constante de iones de NaCl 10 mM.

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Figura 1. Macrófagos murinos, células RAW 264.7 después del tratamiento con GONP. Los parámetros evaluados ( a ) viabilidad celular; ( b ) producción de óxido nítrico; ( c ) Producción de interleucina 6 (IL-6); ( d ) Niveles de proteína inflamatoria 1 alfa (MIP-1α) de macrófagos. Control positivo no representado (803,85 ± 353,70 ng/mL MIP-1α); ( mi ) Niveles de MIP-1β. Control positivo no representado (1127,19 ± 468,69 ng/mL MIP-1β); y ( f ) niveles MIP-2. Control positivo no representado (307,39 ± 171,86 ng/mL MIP-2). Los datos representan la media ± DE con n = 9. Las barras marcadas con símbolos indican una diferencia significativa con el control ( p < 0,01). Importancia demarcada por: *: significativamente diferente en comparación con el control negativo ( p < 0,001), # : significativamente diferente en comparación con el control positivo ( p ≤ 0,005).

Figura 2. El efecto de las nanopartículas de óxido de grafeno (GONP) en células RAW 264.7. Las células se incubaron con ( a ) solo medio (control negativo); ( b ) medios en presencia de LPS y ( c ) 15,6 μg / ml de GONP en ausencia de un mitógeno. Los sobrenadantes se sondaron utilizando la matriz de perfilador de proteoma como se describe en los métodos. A las citocinas/quimiocinas que se detectaron se les asignaron números: 1, 3 y 16 son puntos de referencia; 2-IP-10; 4-G-CSF; 5-TNF-α; 6-GM-CSF; 7-IL-6; 8-JE; 9-sICAM-1; 10-MIP-1α; 11-MIP-1β; 12-IL-1β; 13-MIP-2; 14-IL-1ra; 15-RANTES; 17-IL-27; 18-SDF-1.

Figura 3. Cuantificación de citoquinas secretadas por cultivos RAW 264.7 no estimulados con LPS después del tratamiento con medio solo o medio que contiene 15,6 μg/ml de GONP. Membranas sometidas a exposición cromogénica. Los datos se representan como media ± DE. Las barras marcadas con símbolos indican diferencias significativas ( p < 0,01). Importancia demarcada por: *: significativamente diferente en comparación con el control negativo ( p < 0,001), # : significativamente diferente en comparación con el control positivo ( p < 0,001).

Figura 4. Viabilidad celular de cultivos de células sanguíneas enteras expuestas a GONP. Los datos representan la media ± DE con n = 4. Las barras marcadas con el símbolo indican una diferencia significativa con el control ( p < 0,01). Importancia demarcada por: *: significativamente diferente en comparación con el control negativo ( p < 0,003).

Figura 5. Niveles de expresión de biomarcadores inflamatorios de cultivos de células sanguíneas enteras expuestos a GO. NP en ausencia o presencia de LPS: ( a ) niveles de expresión de IL-6 y ( b ) niveles de expresión de MIP-1β. Los datos representan la media ± DE con n = 4. Las barras marcadas con símbolos indican diferencias significativas ( p < 0,01). Importancia demarcada por: *: significativamente diferente en comparación con el control negativo ( p < 0,001), #: significativamente diferente en comparación con el control positivo ( p < 0,001).

Figura 6. Niveles de expresión de biomarcadores del sistema inmunológico adquirido de cultivos de células sanguíneas enteras expuestas a GONP en ausencia o presencia de PHA: ( a ) niveles de expresión de IL-10 y ( b ) niveles de expresión de IFNγ. Los datos representan la media ± DE con n = 4. Las barras marcadas con símbolos indican diferencias significativas ( p < 0,01). Importancia demarcada por: *: significativamente diferente en comparación con el control negativo ( p < 0,001), # : significativamente diferente en comparación con el control positivo ( p < 0,001).

Figura 7. Los efectos de las GONP en las células sanguíneas completas. Las células se incubaron con ( a ) solo medio, ( b ) medio y LPS, ( c ) 5 μg / ml de GONP en ausencia de LPS. A las citocinas/quimiocinas que se detectaron se les asignaron números: 1, 2 y 13 son puntos de referencia; 3-IL-1ra; 4-FOMIN; 5-MCP-1; 6-Serpina E1; 7-MIP-1α/β; 8-RANTES; 9-ICAM-1, 10-IL-6, 11-IL-8 y 12-IL-1β.

Figura 8. Cuantificación de citocinas secretadas por cultivos de células sanguíneas completas no estimuladas con LPS después del tratamiento con medio solo o con medio que contiene 5 μg/ml de GONP. Membranas sometidas a exposición cromogénica. Los datos se representan como media ± DE. Las barras marcadas con símbolos indican diferencias significativas ( p < 0,01). Importancia demarcada por: *: significativamente diferente en comparación con el control negativo ( p < 0,001), # : significativamente diferente en comparación con el control positivo ( p < 0,001).